卵巢癌腹腔转移工具细胞的构建及其应用 - 万里舟; 杜汝沛; 陈康梅 (Zhongshan Daxue xuebao. Yixue kexue ban)
目的构建稳定共表达荧光素酶（Luc）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的人源卵巢癌细胞SKOV3（SK-Luc-EGFP）并探究其在卵巢癌腹腔转移的体内外研究中的应用。方法利用重叠PCR扩增得到的Luc-T2A-EGFP基因片段，构建重组质粒pCDH-Luc-T2A-EGFP-Puro；采用三质粒慢病毒包装系统转染HEK 293T细胞，收集病毒液感染SKOV3细胞；通过嘌呤霉素筛选，流式细胞术检测，筛选高效表达EGFP的细胞（SK-Luc-EGFP），并通过体外生物发光实验验证Luc的表达。对SK-Luc-EGFP细胞进行如下应用的探究：利用流式细胞术和激光共聚焦区分SK-Luc-EGFP细胞与腹水微环境中的非肿瘤细胞，利用荧光显微镜观察SK-Luc-EGFP与间皮细胞的黏附，利用小动物活体成像仪观察SK-Luc-EGFP细胞的大网膜黏附以及体内成瘤的过程。结果成功构建慢病毒载体pCDH-Luc-T2A-EGFP-Puro；感染并筛选得到SK-Luc-EGFP单克隆细胞株。通过荧光显微镜和流式细胞术均能检测到EGFP的表达，细胞纯度达100%；通过流式细胞术和激光共聚焦成像可直观辨别SK-Luc-EGFP细胞与腹水微环境细胞。体外生物发光试验成功验证Luc的表达，且细胞数和生物发光信号的线性相关系数为0.997 9。细胞黏附试验中通过荧光成像直接观察到SK-Luc-EGFP细胞对间皮细胞的黏附；经腹腔注射SK-Luc-EGFP细胞观察到细胞在裸鼠大网膜上的黏附；在SK-Luc-EGFP细胞建立的卵巢癌腹腔转移模型中，利用小动物活体成像仪实现对腹腔肿瘤的活体监测。结论SK-Luc-EGFP细胞株在卵巢癌腹腔转移的体内外研究中具有多重应用潜力。