miR-155与CEBPB的靶向验证及繁殖性能相关基因的检测 - 李军义; 刘娣; 马红; 汪亮; 霍秀鹏; 郝丽 (野生动物学报)
CEBPB具有调节黄体生成促进排卵的作用，对动物繁殖性能极为重要，试验旨在通过构建CEBPB的3'端非翻译区（3'UTR）双荧光素酶报告基因载体，验证MicroRNA-155（miR-155）调控CEBPB的分子机制。应用在线生物信息学软件预测miR-155与CEBPB基因3'UTR的靶向结合区，PCR扩增获取民猪组织基因组的CEBPB的3'UTR，将其插入psi-Check-2载体，构建野生型（wt-3'UTR）和突变型重组表达载体（mut-3'UTR），鉴定正确后，分别与miR-155模拟物（mimics）/抑制物（inhibitor）/阴性对照物（NC）共转染到PK15细胞，检测荧光素酶活性及CEBPB表达情况。结果表明：成功构建了CEBPB的3'UTR野生型和突变型表达载体，双荧光素酶报告基因检测显示wt-3'UTR/miR-155 mimics组的萤火虫荧光素酶活性受到显著抑制（p<0.05）；而mut-3'UTR/miR-155 inhibitor组的萤火虫荧光素酶相对活性与对照组相比变化不显著（p>0.05）。实时荧光定量结果显示，miR-155 mimics组CEBPB、BMP1和PPARG表达水平显著低于miR-155 NC组（p<0.05），而miR-155 inhibitor组CEBPB表达水平高于miR-155 NC组（p<0.05）。综上表明，miR-155可以靶向负调控CEBPB的表达。