γ-干扰素基因pIRES 改进型黄色荧光蛋白载体的构建 - 蓝育青; 葛 坚; 卓业鸿; 林明楷; 王金林; 刘海泉; 李艳艳 (Zhongshan Daxue xuebao. Yixue kexue ban)
【目的】构建携带γ-干扰素基因(ifn-γ)的pIRES 改进型黄色荧光蛋白载体(pIRES-EYFPIFN-γ), 为γ-干扰素基 因的体内外表达及蛋白定位提供理想的标记。【方法】根据已知γ-干扰素基因序列, 设计在目的片段两端分别带EcoRⅤ和 Not Ⅰ 酶切位点序列的2 条引物, 用PCR 技术从质粒pcDNA3IFN-γ中扩增出ifn-γ(499 bp), PCR 产物用EcoRⅤ 和Not Ⅰ 双 酶切后回收纯化, 定向克隆至商品质粒pIRES-EYFP, 重组质粒pIRES-EYFPIFN-γ用限制性内切酶酶切和DNA 序列分析鉴 定。同时以脂质体为介导, 将pIRES-EYFPIFN-γ转染正常人眼Tenon 囊成纤维细胞, 48 h 后于荧光倒置显微镜下观察基因 的表达。【结果】DNA 序列分析证明PCR 产物为ifn-γ, 将重组质粒转染正常人眼Tenon 囊成纤维细胞, 荧光倒置显微镜下可 见黄色荧光蛋白的表达, 转染率约为43 %。【结论】成功构建pIRES-EYFPIFN-γ载体为利用黄色荧光蛋白标记在体内外进 行γ-干扰素基因表达和蛋白定位奠定基础。