شناسایی و بررسی سیلیمارین قارچ اﻧﺪوﻓﻳﺖ ﺟﺪاﺳﺎزی شده از بذر گیاه خارمریم (Silybum marianum (L) Gaert.) - هدی السادات عقیلی; حسین مرادی; محمد علی تاجیک قنبری; ولی الله قاسمی (Pizhūhish/hā-yi tulīd-i giyāhī)
مقدمه: خارمریم (Silybum marianum (L) Gaert.) از خانواده آستراسه است و سیلیمارین به عنوان ماده موثره با ارزش این گیاه شناخته می‌شود؛ که در درمان تعدادی از بیماری‌ها، مانند بیماری‌های کبدی مورد استفاده قرار می‌گیرد. چالکون‌سنتاز یکی از آنزیم‌های کلیدی در تولید سیلیمارین می‌باشد. قارچ‌های اندوفیت بدون ایجاد بیماری، درون بافت گیاه زندگی کرده و تاثیر مفید بر مقدار تولید متابولیت‎های ثانویه گیاهان دارند. اخیرا چندین قارچ اندوفیت از گیاه خارمریم (Silybum marianum (L) Gaert.) جدا شده و مطالعه شیمیایی و مولکولی آنها مورد توجه قرار گرفته است. بنابراین این پژوهش با هدف جداسازی قارچ‎ اندوفیت از بذر گیاه خارمریم، بررسی و مقایسه سیلیمارین تولیدی قارچ‌ و گیاه، همچنین بررسی توالی‌های آمینواسیدی چالکون‌سنتاز مربوط به گیاه خارمریم (L Silybum marianum.) و چند گونه قارچ دیگر از پایگاه اطلاعاتی NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) انجام شد.مواد و روش‌ها: بدین منظور بذرهای خارمریم از محوطه دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری جمع‎آوری و پس از ضدعفونی در محیط MS کشت شدند. پس از ظهور قارچ در محیط، قارچ‌ها در شرایط استریل به محیط PDA و به‌منظور خالص‌سازی، به محیط WA منتقل شدند. جدایه‌های رشد کرده به محیط PDB منتقل شده و پس از 10 روز استخراج سیلیمارین انجام شد. شناسایی مولکولی جدایه‌ قارچ اندوفیت با تکثیر نواحی ریبوزومی انجام شد، سپس همردیف‌سازی توالی بدست آمده با توالی‌های موجود در سایت NCBI با نرم افزار آنلاین BLAST مورد مقایسه قرار گرفتند و با رسم درخت فیلوژنی قارچ اندوفیت شناسایی شد. بررسی بیوانفورماتیکی چالکون‌سنتاز مربوط به گیاه خارمریم (L. Silybum marianum) و چند گونه قارچ دیگر یا استفاده از پایگاه اطلاعاتی NCBI دامنه‎ها و موقعیت‎های مشابه چالکون‌سنتاز بدست آمد و با برنامه clustalo پایگاه اطلاعاتی uniprot بررسی شد. سپس با نرم‌افزارCLC Genomics Workbench5.5.2 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته و جدول مشخصات آنها رسم گردید. درخت فیلوژنی مربوط به این توالی‌ها با استفاده از نرم‌افزار Mega7 و با روش Neighbor- joining رسم شد.یافته‌ها: نتایج بدست آمده با دستگاه کروماتوگرافی با کارایی بالا، تولید سیلیمارین از قارچ را نشان داد. مقدار سیلیمارین برای نمونه برگ تهیه شده از گیاه خودرو در محوطه دانشگاه، ppm 079/33 و برای گیاه استریل درون شیشه ppm 183/17 و برای قارچ اندوفیت ppm 29/7 اندازه‌گیری شد. شناسایی مولکولی جدایه‌های به‌دست آمده، با استفاده از نواحی ITS انجام و گونه آن،Alternaria alternata شناسایی گردید. همچنین بررسی فیلوژنی چالکون‌سنتاز به عنوان آنزیم کلیدی برای تولید سیلیمارین بین این گیاه و چند قارچ صورت گرفت؛ که بیشترین نزدیکی را در گیاه S. marianum به قارچ Alternaria sp نشان داد.نتیجه‌گیری: بررسی تولید سیلیمارین در قارچ جداسازی شده از بذرهای گیاه خارمریم، گیاه درون شیشه‌ای و فضای باز همراه با مطالعه بیوانفورماتیکی مسیر تولید آنزیم چالکون‌سنتاز، نقش موثر قارچ‌های اندوفیتی را در تولید سیلیمارین مشخص کرد. همچنین این جدایه قارچی قادر به تولید سیلیمارین در شرایط آزمایشگاهی بود.