همسانه‌سازی، توالی‌یابی و بررسی بیان ژن C4H در آنغوزه تلخ Ferula pseudalliacea - پگاه شهیدی; یاور وفایی; بهمن بهرام نژاد; دارا دستان (Pizhūhish/hā-yi tulīd-i giyāhī)
سابقه و هدف: آنغوزه تلخ Ferula pseudalliacea گیاهی از خانواده چتریان، چند ساله و مونوکارپیک می‌باشد. رویشگاه این گیاه آسیای مرکزی تا نوار شمالی اروپا می‌باشد. ترکیبات اصلی تشکیل دهنده متابولیت‌های ثانویه این جنس شامل کومارین‌ها، سزکوئی‌ترپن‌ کومارین‌ها و دی‌سزکوئی‌ترپن‌کومارین‌ها می‌باشد. با توجه به ترکیبات موجود در این گیاه از گذشته‌های دور توسط مردم بومی در طب سنتی به صورت گسترده استفاده شده است. مسیر اصلی بیوسنتز ترکیبات موثر این گیاه مسیر فنیل‌پروپانوئید است. یکی از آنزیم‌‌های اصلی و کلیدی این مسیر سینامات- 4- هیدروکسی لیاز است. هیچ اطلاعات ژنومی از ژن‌های این گیاه دارویی با ارزش وجود ندارد و به‌عنوان اولین گزارش ، ژن C4H از این گیاه همسانه و توالی‌یابی شد و میزان بیان آن در ریشه، ساقه، برگ، گل آذین و بذر نارس مورد بررسی قرار گرفت.مواد و روش‌ها: قسمت‌های مختلف گیاه Ferula pseudalliacea در اوایل خردادماه از جنوب شرقی روستای گزنه در 20 کیلومتری سنندج جمع‎‌آوری گردید. استخراج RNA از بافت های مختلف گیاه Ferula pseudalliacea با روش لیتیم کلرید انجام گرفت. جهت سنتز cDNA ، از کیت سنتز cDNA شرکت یکتا تجهیز در حجم 20 میکرولیتر استفاده شد. محصول پی سی آر با استفاده از آغازگر طراحی شده از نواحی حفاظت شده ژن C4H، درون ناقل pTG19 همسانه شد. نمونه‌های پلاسمید نوترکیب بعد از تایید مولکولی ، جهت تعیین توالی به شرکت آپلاید بیوسیستم ارسال شد. جهت ارزیابی میزان بیان ژن‌ C4H از دو روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی و روش نیمه کمی استفاده شد. دندروگرام داده‌های به دست آمده از توالی‌یابی هر ژن، با استفاده از نرم‌افزار مگا با روش آماری اتصال همسایگی با میزان بوت سترپ برای توالی پروتئینی رسم شد.یافته‌ها: توالی‌های به دست آمده از کلون‌های ژن C4H در پایگاه داده ان سی بی آی با استفاده از BlastX همردیف شد و با توجه به نتیجه بلاست، توالی های دو ژن ذکر شده تایید گردید. این ژن با ژن‌های C4H سایر گیاهان هم خانواده خود در یک گروه قرار گرفت. این ژن بالاترین تشابه را در هر دو سطح توالی نوکلئوتیدی و پروتئین با ژن C4H هویج نشان داد که با هم در یک زیر گروه قرار گرفتند. ژن C4H دارای 7 موتیف بوده که موتیف حفظ شده سیتوکروم سیستئین P450 با توالی FGVGRRSCPG در خانواده سیتوکروم P450 جز آنها می‌باشد. بررسی بیان ژن با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی بالاترین سطح رونویسی را در گل‌آذین و کمترین میزان بیان را در برگ نشان داد.نتیجه‌گیری: C4H به عنوان دومین ژن کلیدی مسیر فنیل‌پروپانوئید نقش انکارناپذیر در تولید ترکیبات فنلی در بافت‌های ویژه همانند گل‌آذین که بیشترین میزان بیان را نشان داد، دارد. سایر پژوهش‌های انجام شده درگیاهان مختلف در زمینه بیان ژن C4H نشان از اختصاصی عمل کردن در تولید ترکیب‌های خاص، در بافت خاصی بوده است. با توجه به اینکه ترکیبات فنلی دامنه وسیعی از متابولیت‎های ثانویه را به صورت مواد فرار (اسانس) و عصاره شامل می‌شود برای پی بردن به نقش دقیق آنزیم C4H در اندام‌های مختلف نیاز به تحقیق بیشتر می‌باشد. با توجه به نقش انکارناپذیر ژن C4H در بیوسنتز بسیار از ترکیبات با ارزش دارویی، از توالی شناسایی شده می‌توان در تولید ترکیبات نوترکیب در سایر گونه‌های گیاهی که پیش‌ماده‌های مورد نظر را دارند، استفاده نمود.