人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达 - 李朝阳; 温南; 杨中汉; 蔡卫斌; 李明友; 刘祖国; 高国全; 杨霞 (Zhongshan Daxue xuebao. Yixue kexue ban)
【目的】 降低成本，增大产出，提高K5突变体（mK5）在原核系统的单位表达量。 【方法】 调整可能影响表达的参数：抗生素浓度、pH、A600值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度，同时固定其它参数。通过电泳分析，获得mK5在原核系统pET22b-BL21的最优表达条件；组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得mK5蛋白，SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定mK5蛋白；MTT法分析mK5对人视网膜毛细血管内皮细胞（HRCEC）增殖的影响。【结果】 优化后的表达条件为：最适细菌培养温度为37℃，最佳抗生素浓度为50μg/mL羧苄青霉素，最适pH值为7.0，在A600为0.9～1.0时加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG为最佳诱导条件，37℃诱导10 h为最佳诱导时间；优化条件后mK5纯化蛋白得率为21 mg/L，产量较优化前(15 mg/L)提高近30％；mK5特异性地抑制HRCEC的增殖，IC50=40 nmol/L。【结论】 本研究确定了mK5蛋白诱导表达的最适参数，并获得具有生物活性的高纯度、高表达量的重组蛋白，为工业化大规模发酵生产提供了基本参数。